Клеточные культуры

Основные принципы культивирования

Выделение клеток

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов , как коллагеназа , трипсин , проназа , разрушающих внеклеточный матрикс . Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей и материалов.

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными . Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определённого количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.

Существуют иммортализованные («бессмертные») линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации , но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путём активации гена теломеразы .

Культивирование клеток

Клетки выращивают в специальных питательных средах , при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур . Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, , концентрации глюкозы , составу факторов роста и др . Факторы роста , используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови . Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование заражённых ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста .

Особенности выращивания клеток

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:

  • Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
  • Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
  • Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл , рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
  • По той же причине может начаться клеточное дифференцирование .

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами , или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин , стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B).

Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики , поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета », согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удалённых с их согласия .

Применение

Клеточные культуры

Метод культуры тканей используется для проведения исследований:

  • процессов внутри клеток (синтез ДНК, РНК и белков, обмен веществ и влияние на него с помощью лекарственных препаратов);
  • межклеточных реакций (прохождение веществ через клеточные мембраны, работа комплекса гормон-рецептор, способность клеток слипаться друг с другом, формирование гистологических структур);
  • взаимодействия с окружающей средой (поглощение питательных веществ, заражение инфекциями, процессы зарождения и развития опухолей и другие);
  • результатов генетических манипуляций с клетками.

Перспективными направлениями биологии и фармакологии, при развитии которых используется данная технология, являются:

  • получение эффективных гербицидов, регуляторов роста для агрономических культур, биологически активных соединений для применения в производстве лекарственных препаратов (алкалоиды, стероиды и другие);
  • направленный мутагенез, выведение новых гибридов, преодоление постгамной несовместимости;
  • клональное размножение, которое позволяет получить большое количество генетически идентичных растений;
  • выведение вирусоустойчивых и безвирусных растений;
  • криоконсервация генофонда;
  • реконструкция тканей, создание источников стволовых клеток (тканевая инженерия).

Применение

Применение в цитологии

В цитологии данный метод удобен тем, что клетки в культуре легко доступны для различных биохимических манипуляций. При работе с ними радиоактивные вещества, яды, гормоны и др. могут быть введены в нужной концентрации в течение требуемого времени. Количество этих веществ может быть на порядок меньше, чем при эксперименте на животных. Исчезает угроза того, что вещество будет Метаболизированный печенью, экскретироваться почками или отложится в мышцах. Это обеспечивает получение реальных значений скорости действия вещества на клетку или ее усвоения клеткой.

Для исследования живых растительных клеток используют культуру изолированных протопластов. Изолированные протопласты можно определить как «голые» клетки растений, поскольку клеточная стенка удаляется механическим или ферментативным способом. Система изолированных протопластов дает возможность вести селекцию на клеточном уровне, работать в малом объеме с большим количеством индивидуальных клеток, получать новые формы растений путем прямого переноса генов, получать соматические гибриды между удаленными в систематическом отношении видами. Поскольку в изолированных протопластах сразу начинается регенерация клеточной оболочки, то они являются удобным объектом для изучения формирования целлюлозных микрофибрилл.

Применение в вирусологии

В вирусологии культуры клеток используются очень широко, поскольку с ними сравнительно легко работать в лаборатории, в отличие от других методов — выращивание вирусов на куриных эмбрионах или в организме живых животных. Кроме того, на монослое клеточной культуры можно хорошо изучить цитопатическое действие вирусов, по образованию внутри- клеточных включений, бляшек, в реакциях гемадсорбции и гемагглютинации и по цветовой пробоя. При работе с культурами клеток существенные результаты могут быть получены при работе с небольшим количеством культур. Эксперименты, которые требуют для подтверждения того или иного факта сотни или тысячи лабораторных животных могут быть с равным статистической достоверностью поставлены на таком же количестве культур клеток. Таким образом при лаборатории не надо держать виварий и отсутствуют этические аспекты обращения с больными животными.

Также изучается трансформация клеток вирусами, механизм которой подобен механизму возникновения злокачественных опухолей.

Применение в фармакологии

Культуры клеток широко применяются для тестирования действия веществ, которые могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов. Несмотря на то, что результаты, полученные на культурах клеток нельзя экстраполировать на весь организм, не вызывает сомнения, что если то или иное вещество нарушает деятельность клеток из нескольких разных линиях культур, то необходимо ожидать негативного эффекта и при введении этого вещества в организм.

Применение в биотехнологии

Специфические культуры клеток является ценным источником гормонов и других биологически активных веществ. Уже сейчас они применяются для производства противовирусного белка интерферона.

Применение в генетике

В генетике способность клеток к росту в культуре используется в следующих направлениях:

  • Клонирование
  • Хранение клеток
  • Получение мутантных клеток и работа с ними

Ограничения

Клеточные культуры

Почему же рано или поздно клеточные культуры гибнут? Это связано с так называемым пределом Хейфлика. Считается, что старение клеток является результатом заложенных механизмов. Что интересно, так это то, что раковые опухоли в этом плане ведут себя немного иначе. Например, они не подчиняются пределу Хейфлика. Кроме этого, когда на поверхности исследовательских сосудов не остается места, они все равно продолжают размножаться. Таким образом, опухолевая клеточная культура становится многослойной. Самый старый ее лабораторный представитель уже «живет» добрые полвека.

Следует отметить, что очень часто наблюдается дифференцирование. Например, могут синтезироваться специфические белки или сохраняются морфологические особенности. Культивирование клеток иногда может привести к появлению новых свойств, но нередки случаи, когда они же пропадают

Это также очень важно при изучении механизмов деятельности. Кстати, эти свойства привели к тому, что некоторые клеточные культуры создаются с практической целью – получение синтезируемых веществ

Именно таким образом и достают антитела к различным белкам.

Культура неклеток млекопитающих

Методы культуры растительной клетки

Культуры растительной клетки, как правило, выращиваются как культуры приостановки клетки в жидкой среде или как культуры костной мозоли на твердой среде. Культивирование недифференцированных растительных клеток и виолончелей требует надлежащего баланса ауксина соматотропинов завода и cytokinin.

Клеточная культура насекомого

Клетки, полученные из Дрозофилы melanogaster (наиболее заметно, Шнайдер 2 клетки), могут использоваться для экспериментов, которые может быть трудно сделать на живых мухах или личинках, таких как биохимические исследования или исследования, используя siRNA. Клеточные линии, полученные из армейского червя Spodoptera frugiperda, включая Sf9 и Sf21, и от выполняющего мертвую петлю летчика капусты Трикоплусии ni, клеток Хлопка по ладони, обычно используются для выражения рекомбинантных белков, используя baculovirus.

Бактериальный и методы культуры дрожжей

Для бактерий и дрожжей, небольшие количества клеток обычно выращиваются на основательной поддержке, которая содержит питательные вещества, включенные в него, обычно гель, такие как агар, в то время как крупномасштабные культуры выращены с клетками, приостановленными в питательном бульоне.

Вирусные методы культуры

Культура вирусов требует культуры клеток млекопитающих, завода, грибковое или бактериальное происхождение как хозяева к росту и повторению вируса. Целые дикие вирусы типа, рекомбинантные вирусы или вирусные продукты могут быть произведены в типах клетки кроме их естественных хозяев при правильных условиях. В зависимости от видов вируса инфекция и вирусное повторение могут привести к клетке — хозяину lysis и формированию вирусной мемориальной доски.

История развития

Клеточные культуры

Первые попытки культивирования растительных тканей предпринимались немецкими учеными на рубеже XIX-XX вв. Несмотря на то, что они оказались неудачными, был сформулирован ряд идей, которые подтвердились в дальнейшем.

В 1922 г. В. Роббинс и В.Котте, независимо друг от друга, смогли вырастить кончики корней кукурузы и томатов на искусственной питательной среде. Детальная проработка техники культуры клеток и тканей началась в 30-е гг. XX в. Р. Готре и Ф. Уайт доказали, что при периодической пересадке тканевых культур в свежую питательную среду они могут расти неограниченно долго.

К 1959 г. в лабораторных условиях выращивалось уже 142 вида растений. Во второй половине XX в. началось также использование диспергированных (разобщенных) клеток.

Культивирование клеток

Введение клеток в культуру, их происхождение

В соответствии с целями и задачами экспериментальной работы можно выделить два направления культивирования животных клеток:

— культуры клеток;

— культуры органов и тканей (органные культуры).

Культуры клеток лишены структурной организации,
теряют характерную гистиотипическую архитектуру и связанные с ней
биохимические признаки и обычно не достигают равновесного состояния
при отсутствии специальных условий. Клетки в культурах размножаются,
что обеспечивает получение большой массы клеток, затем их
идентифицируют (по фенотипическим признакам, путем выращивания в
селективной среде, генотипически), разделяют на идентичные параллели
и, если это необходимо, сохраняют. Динамические свойства
культивируемых клеток часто трудно контролировать, также трудно
реконструировать in vitro некоторые клеточные взаимодействия,
наблюдаемые in vivo. В связи с этим некоторые исследователи
предпочитают использовать клеточные системы, сохраняющие структурную
целостность исходной ткани.

Список типов клеток, которые уже введены в
культуру, достаточно велик. Это элементы соединительной ткани
человека (фибробласты), скелетные ткани (кость и хрящи), скелетные,
сердечные и гладкие мышцы, эпителиальные ткани (печень, легкие,
почки и др.), клетки нервной системы, эндокринные клетки
(надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоциты и
различные опухолевые клетки.

Популяция клеток не всегда гомогенна и обладает
фиксированным фенотипом. Некоторые культуры, например, кератиноциты
эпидермиса, содержат стволовые клетки, клетки-предшественники и
кератинизированные чешуйчатые клетки. В такой культуре происходит
постоянное обновление за счет стволовых клеток, пролиферация и
созревание клеток-предшественников, а также необратимая
дифференцировка, сопровождающаяся «слущиванием» чешуйчатых клеток в
культуральную среду.

Какую ткань лучше брать для введения в культуру,
взрослую или эмбриональную, нормальную или опухолевую? Культуры,
полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей
выживаемостью и более активным ростом по сравнению с
соответствующими зрелыми тканями. Причиной этого служит низкий
уровень специализации и наличие реплицирующихся
клеток-предшественников в эмбрионах. Пролиферативная способность
взрослых тканей ниже, они содержат больше неделящихся
специализированных клеток. Получение первичных культур клеток
взрослых тканей и их размножение является более сложной задачей,
продолжительность жизни таких культур, как правило, невелика.
Нормальные ткани дают начало культурам с ограниченным временем
жизни, тогда как культуры, полученные из опухолей, способны
пролиферировать неограниченно долгое время. Дифференцировка
нормальных клеток в культуре сопровождается обычно полным
прекращением пролиферации клеток. В культурах опухолевых клеток
возможна частичная дифференцировка при сохранении способности к
пролиферации.

Свежевыделенные культуры носят название первичных
культур до начала пассирования или субкультивирования. Клетки
первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются низкой
пролиферацией. В них наиболее полно представлены типы клеток той
ткани, откуда они были получены. Пассирование обеспечивает
возможность продления существования культуры, возможность
клонирования, исследования и сохранения свойств клеток. При этом
получаются более однородные популяции, а также теряются
специализированные клетки. После нескольких пересевов линия клеток
либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной
линией. Свойством «бессмертности» обладают в основном клетки,
полученные из опухолей. Появление постоянной линии клеток
констатируется по морфологическим изменениям (уменьшение размера
клеток, снижение их адгезивности, округление, увеличение
ядерно/цитоплазматического отношения, по увеличению скорости роста
(время удвоения клеток в культуре снижается с 36 — 48 до 12 — 36
часов), по снижению зависимости от сыворотки, по увеличению
эффективности клонирования, по снижению зависимости от субстрата, по
увеличению гетероплоидности (хромосомные различия между клетками) и
анеуплоидности и по увеличению опухолеродности. Нормальные клетки
могут трансформироваться в постоянную линию, не становясь при этом
злокачественными.

Читать дальше ► морфофизиологические характеристики культивируемых животных клеток

Вводная информация

Клеточные культуры

Так что же собой представляют клеточные культуры? Как известно, организм не является чем-то целостным. Он формируется из различных клеток, каждая из которых выполняет определенную функцию. Если отделить их грубым методом, то они быстро погибнут. Но клетки можно аккуратно извлекать и создавать им такие условия, в которых они смогут продолжать свою деятельность и размножаться. Вот так и формируются клеточные культуры.

Как же их получают? Как ни странно, но в качестве основы используются такие клетки, которые потеряли способность к делению в составе организма. Например, лейкоциты периферической крови. Использование культивирования позволяет решать ряд теоретических проблем. Кроме этого, благодаря нему был дан ответ на целый ряд прикладных задач.

Общие клеточные линии

Линии клетки человека

60 линий раковых клеток национального Онкологического института (NCI60)

  • DU145 (рак простаты)
  • Lncap (рак простаты)
  • MDA-MB-438 (рак молочной железы)
  • PC3 (рак простаты)
  • T47D (рак молочной железы)
  • THP-1 (острая миелоидная лейкемия)
  • U87 (глиобластома)
  • Клетки нейробластомы Человека SHSY5Y, клонированные от миеломы
  • Клетки Saos-2 (рак костей)
  • Клетки KBM-7 (хроническая миелогенная лейкемия)

Клеточные линии примата

Vero (африканская зеленая обезьяна линия эпителиальной клетки почки Chlorocebus, начатая в 1962)

Опухолевые клеточные линии крысы

  • GH3 (гипофизарная опухоль)
  • PC12 (феохромоцитома)

Клеточные линии мыши

MC3T3 (эмбриональный calvarium)

Линии растительной клетки

Табак — 2 клетки (сохраненный как культура приостановки клетки, они — образцовая система растительной клетки)

Другие клеточные линии разновидностей

  • Данио-рерио ZF4 и клетки AB9
  • Линия эпителиальной клетки почки собаки Madin-правила-штукатура (MDCK)
  • Эпителиальные клетки почки Xenopus A6

Культуры клеток не млекопитающих

Культуры клеток растений

Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определенного баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов .

Бактериальные, дрожжевые культуры

Основная статья: Бактериальная культура

Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара . Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).

Вирусные культуры

Извлеченным из организма клеткам можно создать такие условия, при которых
они будут жить и размножаться в искусственной среде (in vitro — вне
организма, в отличие от in vivo — в организме), образуя культуру клеток.
Клеточные культуры можно получать из таких клеток, которые в составе
организма потеряли способность к делению, например из лейкоцитов
периферической крови. Изучение поведения клеток в культуре помогает понять
механизмы контроля деления клеток. Установлено, что в этом контроле главную
роль играют клеточные взаимодействия. Наблюдение за клеточными культурами
показало, что клетки активно делятся и расползаются по стеклу сосуда, в
котором их культивируют до тех пор, пока они не начнут соприкасаться друг с
другом. Контакт поверхностей соседних клеток приводит к остановке их
движения и одновременно выключает клетки из размножения. Когда клетки
плотным слоем покроют всю доступную им поверхность сосуда, деления
прекратятся. Некоторое время клетки будут жить, потом в них начнут
возникать всевозможные нарушения, и если часть клеток не пересадить в
другой сосуд, на новую среду, то культура погибнет. Интересно, что пересев
клеток на новую среду не всегда стимулирует клеточное размножение. Клетки,
претерпевшие несколько пересевов, со временем не приступают к делению даже
на новой среде. Специальные эксперименты показали, что клетки, взятые из
тканей взрослых организмов, способны делиться in vitro меньшее число раз,
чем клетки, полученные из эмбрионов. Причину этого явления, названного по
имени открывшего его ученого феноменом Хейфлика
, многие исследователи видят в старении клеток, и в настоящее время
клеточные культуры служат объектом изучения механизмов старения на
клеточном уровне. Клетки, взятые из раковых опухолей, ведут себя в культуре
немного иначе. Контакт поверхностей клеток не останавливает их делений, они
продолжают размножаться и культура становится многослойной. Не подчиняются
опухолевые клетки и правилу Хейфлика: они могут претерпевать неограниченное
число делений. Некоторые клетки в культуре остаются дифференцированными:
синтезируют специфические белки, сохраняют морфологические особенности,
например опухолевые клетки лимфоидного происхождения. Другие клетки при
переносе их в искусственные условия становятся недифференцированными.
Изменение условий выращивания иногда приводит к потере, иногда к
приобретению свойств дифференцированных клеток. Это позволяет использовать
клетки в культуре для изучения механизмов клеточной дифференцировки.
Сохранение некоторыми клетками in vitro дифференцированного состояния
послужило толчком для создания клеточных культур с практическими целями для
получения из них веществ, которые синтезируются этими клетками. Так
получают антитела к различным белкам. Можно получать и лекарственные
вещества из клеток тех растений, которые плохо выращиваются на плантациях.
Клеточные культуры нашли применение и в медицине. Для диагностики
наследственных заболеваний иногда необходимо достаточно большое количество
клеток организма для того, чтобы можно было провести биохимический анализ.
Если диагноз нужно установить у эмбриона человека, то взятие материала на
анализ представляет большую проблему. В этом случае на помощь приходит
техника клеточных культур: несколько сотен клеток, взятых из ворсинок
оболочки зародыша без вреда для него, достаточно, чтобы вырастить большую
клеточную массу. Клеточные культуры используют и в вирусологии — для
выращивания вирусов и изучения их свойств, а также в фармацевтической и
химической промышленностях для исследования повреждающего действия на ДНК и
хромосомы вновь синтезированных химических веществ.

Клеточные культуры —
это генетически однородные популяции клеток, растущих в постоянных условиях окружающей среды. Это могут быть штаммы нормальных клеток человека, животных, растений или тканей злокачественных опухолей.

Различия в моделях

Исследования в тканевой инженерии, в области стволовых клеток и молекулярной биологии в первую очередь включают в себя выращивание клеточных культур на плоских пластиковых блюдах. Этот метод известен как двумерная (2D) клеточная культура и впервые был разработан Вильгельмом Ру, который в 1885 году удалил часть медуллярной пластинки эмбриональной курицы и поддерживал ее в теплом физиологическом растворе в течение нескольких дней на плоском стекле.

От продвижения полимерной технологии возникла современная стандартная пластиковая посуда для двумерной клеточной культуры, широко известная как чашка Петри. Юлий Рихард Петри, немецкий бактериолог, как правило, упоминается в научной литературе как автор этого изобретения, работал помощником Роберта Коха. Сегодня различные исследователи также используют культуральные лабораторные колбы, конические и даже одноразовые мешки, подобные тем, которые используются в одноразовых биореакторах.

Клеточные культуры

Помимо культуры хорошо устоявшихся иммортализованных клеточных линий, клетки из первичных эксплантов множества организмов могут культивироваться в течение ограниченного периода времени до появления чувствительности. Культурные первичные клетки широко использовались в исследованиях, как в случае кератоцитов рыб в исследованиях миграции клеток. Среды для культивирования клеток при этом могут использоваться самые разные.

Культуры растительных клеток обычно выращивают в виде культур клеточной суспензии в жидкой среде или в культурах каллюса на твердой среде. Культура недифференцированных растительных клеток и калли требует надлежащего баланса гормонов роста растений ауксина и цитокинина.

Связь с генетикой

Биологические продукты, полученные с помощью технологии рекомбинантной ДНК (рДНК) в культурах животных, включают ферменты, синтетические гормоны, иммунобиологические (моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины) и противораковые агенты. Хотя многие более простые белки могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, которые гликозилированы (модифицированы углеводами), в настоящее время должны быть сделаны в клетках животных.

Важным примером такого комплексного белка является гормон эритропоэтин. Расходы на выращивание клеточных культур млекопитающих высоки, поэтому ведутся исследования по созданию таких сложных белков в клетках насекомых или на высших растениях. Использование отдельных эмбриональных клеток и соматических эмбрионов в качестве источника прямого переноса генов путем бомбардировки частицами, экспрессии транзитных генов, и конфокальная микроскопия является одной из областей ее применений. Культивирование растительных клеток является самой распространенной формой этой практики.

Клеточные культуры