Иммуногистохимическое исследование

Гистохимия (окрашивание срезов в гистологии)

Перед тем, как патологоанатом (морфолог) начнёт рассматривать под микроскопом участок ткани молочной железы, полученный в результате биопсии, ему необходимо его окрасить специальными красителями.

Гистохимические красители наносят на тонкий срез участка ткани, чтобы рассмотреть под микроскопом, какие клетки там присутствуют, их расположение по отношению друг к другу (структуру ткани). Световая микроскопия является рутинным методом изучения окрашенных срезов ткани, широко используется в диагностике рака молочной железы. Наиболее часто для окрашивания срезов ткани используют:

Гематоксилин — окрашивает клеточное ядро в темно-синий цвет;
Эозином — делает цитоплазму клеток розовой. Совместное их использование называется гематоксилин-эозиновое окрашивание.

Что такое иммуногистохимия (ИГХ)

Патологоанатом — это врач, который долго учился в медицинском университете, чтобы знать, как с помощью микроскопа отличить в окрашенном срезе ткани раковые клетки от нормальных. Обычно для постановки диагноза (доброкачественная это патология или злокачественная) ему достаточно рассмотреть под микроскопом срез ткани, окрашенный гематоксилином и эозином. Но иногда этого бывает недостаточно. В такой ситуации на помощь приходит иммуногистохимия, которая к морфологической идентификации клеток и тканей добавляет иммунологический компонент.

Методика иммуногистохимии (ИГХ) дополняет морфологическое распознавание клеток и тканей, используя антитела к известным антигенам, которые являются специфическими для определенных типов клеток или клеточных компонентов. Расположение этих антител можно увидеть, используя световую микроскопию, так как антитела содержат зрительно-распознающиеся метки.

Первые методики иммуногистохимического анализа рака молочной железы использовали антитела с прикрепленными к ним флуоресцирующими метками, что требовало применения специального флуоресцентного микроскопа, позволяющего увидеть локализацию этих антител в срезе ткани молочной железы.

За последние 30 лет удалось существенно упростить методику, которая применяется при ИГХ исследовании молочной железы, за счет использования более специфичных антител (моноклональных антител) с ферментативными метками. Это, в свою очередь, позволило при иммуногистологических исследованиях молочной железы использовать световую микроскопию, которая намного дешевле, и поэтому наиболее доступная. Однако радиоактивные элементы (пероксидаза, щелочная фосфатаза и флуоресцеин), без которых иногда не обойтись, требуют специальных методик и до сих пор широко используются.

Возникшая ситуация у каждой конкретной женщины с раком молочной железы требует применения тех или иных наборов антигенов (панелей антигенов), что в свою очередь требует от специалиста, выполняющего ИГХ, исследование срезов ткани молочной железы, знаний и громадного опыта.

Необходимость использования иммуногистохимии при раке молочной железы, контроль её качества и интерпретация полученных результатов должны контролироваться патоморфологическим отделением

Важно, чтобы расшифровка полученных данных при ИГХ исследовании использовалась только в сочетании с морфологическим анализом тканей молочной железы, полученным в результате покраски их гематоксилином и эозином

Сегодня иммуногистохимическое исследование при раке молочной железы является рутинным методом в большинстве морфологических (патогистологических) лабораториях и используется для уточнения диагноза, а также с прогностической целью, в качестве предикативного (предсказывающего) указателя, как поведет себя рак молочной железы в дальнейшем.

Какие результаты показывает ИГХ

Результаты исследования дают возможность врачу определить, в какой период наблюдается имплантационное окно. Это временной промежуток, в который отмечается максимальное соответствие плодного яйца и маточного слоя. При этом удается выявить наличие или отсутствие пиноподий (возвышенностей на поверхности эндометрия).

Период, благоприятный для закрепления плодного яйца в полости матки, высчитывают по циклу менструаций. Как правило, имплантационное окно наблюдается в период с 20-х по 24-е сутки, когда степень развития маточного слоя и эмбриона находится в максимальном функциональном соответствии.

В процессе изучения морфологии слоя детородного органа полученные показатели дают возможность диагностировать следующие нарушения в репродуктивной системе:

воспалительные процессы (диффузные и очаговые инфильтраты лимфоидных клеток, плазматические клетки в строме),
склеротические изменения в артериальных стенках,
полипы в полости детородного органа,
гиперплазию, эндометрит, протекающий в скрытой, хронической форме,
пиноподии (отсутствие их или наличие),
строение и форму рецепторов, степень их чувствительности к эстрогену и прогестерону.

В процессе подготовки к экстракорпоральному оплодотворению ИГХ дает возможность точно определить чувствительность эндометрия к воздействию гормонов. Этот момент крайне важен для удачной реализации программы репродукции.

Данные, полученные в результате исследования, помогают выявить сдвиги имплантационного окна и определить состояние маточного слоя на определенных этапах цикла. Кроме того, появляется точная информация о воспалительных процессах, протекающих в матке. Они нередко становятся причиной бесплодия.

Иммуногистохимическое исследование является хоть и сложным, но точным методом определения состояния эндометрия. С помощью этой процедуры удается определить, какие факторы препятствуют удачному оплодотворению, и диагностировать ряд патологий. ИГХ дает максимально развернутое представление о состоянии репродуктивной системы, показывает уровень чувствительности маточных рецепторов к гормональному воздействию. Это является крайне важным при проведении экстракорпорального оплодотворения и в борьбе с бесплодием. Зачастую после проведения диагностики и правильно подобранной тактики лечения проблемы с зачатием удается устранить.

Что показывает ИГХ?

Выявляемые в ходе иммуногистохимического исследования вещества являются маркерами различных происходящих в организме пациента процессов.

Расшифровка и интерпретация ключевых параметров, исследуемых с помощью гистохимии, поможет более подробно разобраться в вопросе.

HER2

Анализ на HER2 – стандартная процедура при подозрении онкологии молочной железы.

Он позволяет выявить вещества, свидетельствующие о наличии популяции пролиферирующих (бесконтрольно делящихся), что и характеризует опухолевые заболевания.

Объектом ИГХ исследования на HER2 является микроскопический образец ткани молочной железы. Интерпретация результатов анализа представлена в таблице:

Индекс	Наименование	Интерпретация
HER2-отрицательный	Опухоль малоагрессивна
1+ или (+)	HER2-отрицательный	Рекомендуется проведение анализа FISH
2+ или (++)		Спорное значение – невозможно дать однозначный результат с помощью методики ИГХ. Обязательно обследование FISH!
3+ или (+++)	HER2-положительный	Выраженная агрессивность опухоли – раковое заболевание

Расшифровка аббревиатуры HER2 – human epidermal growth factor receptor 2 – рецептор фактора эпидеомального роста у человека. В норме он отвечает за деление и рост клеток.

FISH

Анализ ФИШ при раке молочной железы или FISH-исследование – дорогостоящий, но более точный метод, способный однозначно выявить амплификацию (аномальное увеличение) фактора HER2.

При анализе FISH также используются подкрашенные маркеры, однако в данном случае они вступают в реакцию с отдельными участками хромосомы, что позволяет получать гораздо более точный результат.

При исследовании возможны только два показателя индекса:

HER2-негативный рак молочной железы — Амплификация отсутствует, соответствует показателю 0 при исследовании HER2.

HER2-позитивный рак молочной железы — Амплификация присутствует, соответствует показателю 3+ при анализе HER2.

Обследование FISH не оставляет недомолвок, результат индекса трактуется однозначно.

KI-67

KI-67 при раке молочной железы (КИ 67) является маркером пролиферации (пролиферативная активность – показатель интенсивности деления клеток).

Анализ на KI-67 маркер проводится при выявлении злокачественной опухоли и ставит своей целью определение эффективности химиотерапевтических методов лечения.

Результат анализа обозначается в процентах (KI-67 n%) и интерпретируется следующим образом:

КИ 67 < 30% — Химиотерапия неэффективна, показана гормональная терапия

КИ 67 30-50% — Применима химиотерапия в сочетании с другими методами лечения

КИ 67 > 50% — Химиотерапия эффективна

В дополнение к анализу на индекс КИ 67 нередко назначают иммуногистохимию при раке молочной железы на белок P53.

Анализ на маркер пролиферативной активности по KI-67 позволяет применять химиотерапию только при максимальной ее эффективности.

Белок P53

В организме белок P53 играет роль регулятора клеточного цикла. Данный элемент является маркером злокачественности опухоли – то есть, способности опухолевых клеток образовывать метастазы.

ER/PR

Еще одно распространенное иммуногистохимическое исследование при раке грудной железы. ER и PR – это рецепторы к эстрогенам и прогестерону соответственно.

Наличие этих рецепторов в образце служи маркером того, что опухоль развивается под воздействием гормонов. Следовательно, необходимо лечение методами гормональной терапии.

Результат анализа ER/PR обозначается в баллах от 0 до 10. Чем выше показатель, тем выше чувствительность к гормональной терапии:

ER/PR <2 — Опухоль нечувствительна к гормональной терапии

ER/PR 2-10 — Рекомендуется гормональное лечение

Интенсивность гормонального лечения определяется показателем ER/PR.

Роль иммуногистохимии в определении “прогностических” и “предиктивных” факторов при раке молочной железы

Прогностические факторы предоставляют информацию о возможном поведении рака молочной железы на момент его диагностики и не зависят от терапии. То есть с помощью них можно судить, как будет быстро прогрессировать рак и, соответственно, в зависимости от этого принять решение, какой объем и лечение предпочтительны в каждой конкретной ситуации.

В свою очередь, “предиктивные” (предсказывающие) факторы обеспечивают информацией, которая позволяет судить о вероятности ответа опухоли на конкретную терапию. Несмотря на то, что прогностические и предиктивные факторы возможно систематизировать по отдельности, в диагностике и классификации рака молочной железы чаще они являются как прогностическими, так и предиктивными.

Например, наличие высокой экспрессии HER2. Если рак молочной железы her2 положительный (большое количество в опухоли белка HER2), то он протекает агрессивно, с ранним метастазированием в отдаленные органы. А если опухоль содержит малое количество этого белка (рак молочной железы her2 негативный), она не будет реагировать на применение таргетного препарата герцептина.

Рекомендуем прочесть статью о том, что такое люминальный рак молочной железы. Из нее вы можете узнать, как современные методы исследования помогают определить подтипы рака, как выбирают оптимальный метод лечения рака молочной железы в зависимости от результатов исследования.

“Базальные” ИГХ маркеры

Существует подразделение рака молочной железы в зависимости то того, какие гены экспрессируют его клетки (профиль экспрессии генов). Опухоли, профиль которых характерен для базальных или миоэпителиальных клеток нормальной молочной железы, будут показывать наличие «базальных» маркеров. Такие опухоли имеют неблагоприятный прогноз. В большинстве из этих «базальных» опухолей полностью отсутствуют ER, PR (рецепторы к эстрогену и прогестерону) и белок HER2. Они часто метастазируют в головной мозг, в легкие.

На сегодня нет консенсуса по иммуногистохимическому профилю (какие ИГХ маркеры должны применяться), который бы четко определял эти «базальные» раки. К этим опухолям с плохим прогнозом относится и так называемый «трижды негативный рак молочной железы», в котором отсутствуют ER, PR и HER2, но экспрессируются базальные цитокератины 5/6 и 14, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и C-KIT. Они могут также экспрессировать P-кадгерин и часто p63.

Есть сходство между «базальным» раком молочной железы и раками, которые выявляются у женщин с BRCA1 мутацией.

EGFR экспрессируется часто в «базальных» раках, поэтому пациентки с такими опухолями могут извлечь пользу при лечении ингибиторами EGFR.

ИГХ маркеры пролиферации (скорости роста опухоли)

Количество митозов или процент клеток, находящихся в митозе, давно считается морфологическим «биомаркером» прогноза рака. Существует ряд ИГХ маркеров, которые демонстрируют пролиферативную активность клеток (количество митозов):

Ki67 — антиген, который экспрессируется в ядрах клеток на всех этапах клеточного цикла и является полезным маркером клеточной пролиферации;
MIB1 — антитело, которое реагирует с Ki-67 в ткани, зафиксированной формалином или парафином;
PPh3.

ИГХ маркеры апоптоза

Апоптоз или «запрограммированный суицид клетки» является биомаркером агрессивных опухолей. Белки апоптоза можно идентифицировать с помощью ИГХ:

Bcl-2;
Вах;
Bcl-X.

Другие “прогностические” маркеры

р53. Мутации в гене р53 супрессора опухолей (TP53) выявляются в 20-30% случаях рака молочной железы. Эти генные мутации наблюдаются чаще у женщин с наследственными синдромами рака молочной железы, чем у женщин с спорадическим раком. Для пациентки с генетической предрасположенностью к раку молочной железы может быть рекомендовано р53-тестирование. Обнаружение мутаций в р53 также рассматривается в качестве возможного предсказателя ответа рака молочной железы на химиотерапию, но обнаружение белка р53 иммуногистохимически в опухоли не отражает статус мутации р53.
Топоизомераза II альфа. Это мишень, на которую направлено действие антрациклина — химиотерапевтического препарата, который часто используется в лечение рака молочной железы.

Методика проведения анализа

Реакцию можно получить несколькими способами. Часто применяется прямой, при котором используется один вид маркированных антител. Последние должны связаться с выявляемым веществом или молекулой-мишенью. Если последняя присутствует в биоптате, то исследуемая ткань окрашивается.

Непрямой метод считается более информативным и чувствительным. Его суть заключается в поэтапном введении 2 разных антител. Немаркированные первичные антитела вступают в реакцию с опухолевым антигеном в биоптате, образуют комплекс антитело-антиген. Затем вводят вторичные уже маркированные антитела (реагент), которые связываются с определенной частью молекулы первичного антитела. Т. е. первичные антитела являются антигенами для вторичных.

Этот анализ показан пациентам с подозрением на рак молочной железы или людям, которые испытывают неприятные ощущения или боль при прощупывании сосков. Иммуногистохимическое исследование помогает врачам выявить расположение опухоли. Однако если в организме появились метастазы, иммуногистохимия выявит и их.

Большое преимущество метода – отсутствие противопоказаний. Любой мужчина или женщина может сдать анализ, если переживает из-за неприятных ощущений или болей в груди. Если опухоль выявлена на раннем этапе (когда она состоит из доброкачественных клеток), пациенту не потребуется операция или вредная для иммунитета химиотерапия. В этом случае достаточно провести курс гормональной терапии. Положительный исход наступает в 75–80 % случаев.

Исследование применяют:

Для определения первичных новообразований.
Для выявления метастазов.
Данный анализ помогает определить прогноз развития и протекания патологии.
Анализ служит одним из методов исследования рецепторов к ряду гормонов.
ИГХ-исследование позволяет обнаружить микроорганизмы.
Метод исследования применяют для выяснения чувствительности раковых клеток к химиотерапии и радиотерапии.

Преимуществом такого метода исследования является также отсутствие противопоказаний. Сложность может возникнуть только в том случае, если раковое образование расположено в труднодоступном месте.

Кусочек ткани помещают в формалин и направляют в лабораторию, где его подвергают изменениям:

Материал обезжиривают специальными составами и заливают парафином. В таком состоянии он может храниться практически вечно, поэтому при необходимости исследование можно повторять.
На следующем этапе получают тончайшие срезы — проводят микротомирование. Их размещают на специальных стеклах.
Приготовленные срезы обрабатывают растворами антител определенной концентрации. Использовать для обработки могут составы, содержащие разное количество антител. Какие из них вступят во взаимодействие с раковыми клетками, будет зависеть от разновидности опухоли.

Результаты исследования будут готовы только через одну или две недели.

Пациенту делают биопсию перед ИГХ-исследованием. Что это такое? Под местной анестезией из опухоли отщипывают кусочек ткани (биоптат). Этот материал и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях на анализ берут ткани, удаленные в ходе хирургической или эндоскопической операции.

Затем биоптат обезжиривают и обрабатывают парафином. Это необходимо для сохранности материала. В результате получают парафиновые блоки, которые затем нарезают чрезвычайно тонкими слоями.

Полученные срезы обрабатывают препаратами с антителами к разным видам злокачественных клеток. Могут использоваться следующие наборы для анализа:

Малая панель. В этот набор входит до 5 антител.
Большая панель. Может содержать от 6 до нескольких десятков видов антител.

Выбор необходимых антител для исследования зависит от предполагаемого диагноза. В направлении на анализ лечащий врач указывает – какие именно виды антигенов необходимо выявить у пациента. В зависимости от этого и подбирают реагенты для теста.

Положительные и отрицательные стороны

Преимущества метода:

Требуется минимум биоматериала и реактивов;
Определяет рак на ранней стадии;
Быстрый результат;
Точность и достоверность.

Дополнительное преимущество – в возможности трехмерного моделирования. Ответная реакция на антитела видна через три часа. Окончательное заключение дается через 7-10 дней. По истечении этого времени будет точно установлен тип рака и стадия заболевания, а также его первичный очаг. Изменение цвета маркеров обычно не имеет разночтений при постановке диагноза. На итоговом бланке прописывают расшифровку результатов.

Достоверность зависит от метода окрашивания образца реактивами. Это делается автоматически и вручную. При ручном методе не исключён человеческий фактор, ошибки лаборантов. Лечащий врач подскажет, в какую лабораторию обратиться. Пациент может самостоятельно поинтересоваться, как проводится анализ в конкретном учреждении. Для достоверности результата он может проводиться повторно или в двух лабораториях.

Погрешность в результате возникает по вине пациента. Перед биопсией следует отказаться от гормональных препаратов и других лекарств, от физических нагрузок, придерживаться диеты. Внешние факторы влияют на результаты.

Как делается анализ?

Чтобы провести исследование, необходимы образцы самой опухоли и близлежащих тканей. Их можно получить при биопсии или после хирургического вмешательства. Материалу необходимо пройти несколько этапов подготовки перед исследованием: фиксация, промывание, обезвоживание, погружение в парафин или заливка другим веществом.

Исследуемый биологический объект должен получиться плотным, но не хрупким. Сначала материал промывают, обезвоживают и уплотняют в спиртах возрастающей крепости. Затем его просветляют путем погружения в смесь абсолютного спирта и О-ксилола в пропорции 1:1. После этого помещают в несколько порций чистого О-ксилола. И только потом биологический объект пропитывают в парафине. Последний этап помогает законсервировать ткань и на долгое время сохранить ее структурные особенности в парафиновом блоке.

Затем лаборант производит с этих блоков срезы, при помощи специального прибора — микротома, толщиной до 1 мкм. Полученные срезы наклеивают на предметное стекло, которое смазано глицерином и смесью белка. Подсушивают.

Чтобы исследуемый материал вступил в реакцию с антителом, необходимо его обезжирить и удалить парафин. Процедура называется депарафинизация. Для ее проведения используют 3 порции О-ксилола, а также спирты нисходящей крепости.

Последний этап — окрашивание. Оно проводится для того, чтобы четко видеть структуру тканей под микроскопом. Лаборанты могут использовать огромное количество красителей. Условно их можно классифицировать по:

происхождению, например, животные — кармин, растительные — гематоксилин, синтетические — эозин;
химическим свойствам, например, нейтральные, основные, кислые.

Чаще всего для этой процедур используют эозин, гематоксилин. Биологический материал помещают в раствор гематоксилина на несколько минут, затем промывают и дифференцируют результаты окрашивания. После этого провидится окрашивание в эозине, промывание и обезвоживание в спиртах восходящей крепости. Последовательная многоэтапная окраска позволяет на каждом этапе все больше определить нозологию и фенотип опухолевого образования. Патоморфолог изучает материл под микроскопом после каждого окрашивания. И только после оценки изменений и интерпретации полученной информации, назначает панель антител.

Чтобы получить точные данные о патологическом процессе и верифицировать заболевание лаборант приступает к обработке подготовленного образца специальными реактивами, содержащими меченые антитела. В результате происходит реакция между антителом и антигеном. Это сопровождается характерной визуализацией, которая зависит от веществ, используемых для маркировки.

Как проводится ИГХ-исследование

При подозрении на онкологическое заболевание проводится исследование молочной железы. Расшифровка иммуногистохимического исследования содержит всего четыре порога. Но проблема в том, что средние два значения, а это будет 1+ и 2+ по шкале, предполагают неясный результат, требующий дополнительного исследования другим методом. То есть ИГХ-исследование — наиболее неоднозначный метод выявления герцепт-статуса новообразования. К тому же на результат исследования активно влияют, как уже упоминалось, человеческий фактор и внешние обстоятельства. Единственное, что наиболее точно определяются два крайних результата — отрицательный 0 (новообразование имеет отрицательный герцепт-статус) и 3+ (гормональный статус опухоли положительный).

Когда требуется ИГХ, показания

Для того чтобы ответить на вопрос о показаниях, и выяснить, для чего нужно ИГХ исследование, сначала необходимо уяснить, что же это такое.

Все наверняка помнят со школьных лет опыт, когда капля настойки йода с абсолютной точностью выявляла в образце крахмал.

Йод вступал с крахмалом в реакцию, результатом которой было образование пятна характерного темно-фиолетового цвета.

Тот же принцип положен и в основу ИГХ, с той только разницей, что реакция вещество-антитело не имеет видимых цветовых эффектов.

Воздействие производится реактивами, содержащими антитела к искомому веществу. Антитело вступает в реакцию с объектом исследования, обозначая его присутствие.

Но ученные нашли выход: антитела подкрашиваются искусственно. Вступившие в реакцию вещества образуют с искомым элементов связи, наглядно обозначая присутствие последнего.

Гистохимический метод исследования позволяет с высокой точностью выявлять вещества, сопровождающие образование злокачественных изменений в организме – раковых клеток и метастазов.

Благодаря этому тесту можно определиться с дальнейшим прогнозом. Таким образом, основное показание к ИГХ исследованию – подозрение у пациента онкологических заболеваний, конкретно, РМЖ.

Возможности гистологического исследования ИГХ:

определение типа (злокачественное/доброкачественное) образований;
прогноз возможного развития опухолевого заболевания;
выявление метастазирования карциномы;
определение эффективности различных способов лечения;

Кроме того, ИГХ метод имеет широкое распространение в других областях медицины, в частности, в гинекологии, где большое распространение получило иммуногистохимическое исследование эндометрия.

Применение метода в диагностике

Показания к анализу:

Патологии репродуктивной системы, бесплодие;
Активный опухолевый рост любой локализации.

Противопоказаний к анализу нет. Порой невозможно получить биоматериал для исследования из-за расположения опухоли.

Иммуногистохимия эндометрия – важное исследование для нахождения причин бесплодия. Его цель – найти антиспермальные клетки, препятствующие оплодотворению

Причиной бесплодия становится нечувствительность эндометрия к гормонам во время овуляции. При этом показатели гормонального фона в норме, антиспермальных тел нет. Иммуногистохимическая диагностика выявляет, что проблема в рецепторах эндометрия.

Трудно поддаются диагностике тимомы. Их деление на злокачественные и доброкачественные условно. Всё зависит от конкретного случая. Статус опухоли вилочковой железы, тимуса показывает исследование на антитела.

ИГХ при раке прямой кишки применяется, чтобы установить эпителиальный или эндокринный характер опухоли, наследственный фактор и прогноз. Методика определяет первичное ли заболевание и метастазы.

UpSize — эффективное средство для увеличения груди на рынке

Многие современные женщины столкнулись с необходимостью эстетического моделирования бюста. Роскошные формы хотят практически все. И не удивительно, ведь декольте во все времена было зоной повышенного внимания мужчин.

В результате ежедневного применения крема через 3-4 недели объем груди увеличивается, форма становится более округлой и подтянутой; кожа — эластичной и бархатистой.

Крем прошел клинические испытания, проведенные специалистами Всемирной организации здравоохранения в 14 странах мира. Тысячи женщин убедились в эффективности крема UPSIZE.

Деоксимироэстролобладает ярко выраженным омолаживающим эффектом, способствует росту груди;
Экстракт корня Пуэрария Мирификаэффективно питает и защищает кожу;
Эфирное масло розыповышает упругость и эластичность кожи, устраняет и предотвращает возникновение растяжек.

Мы рекомендуем!

С завистью смотрите на пышногрудых красавиц, которые только одним своим появлением приковывают к себе все взгляды мужчин? И кажется, обладают какой-то природной женственностью. Но маленький бюст больше не приговор! Узнайте как увеличить грудь раз и навсегда … Читать далее »