Анализ крови на пцр

Для чего необходимо исследование методом ПЦР?

В медицинской области находит широкое использование ПЦР диагностика инфекций, в том числе и передаваемых преимущественно половым путем:

• герпетической, вызванной вирусами герпеса генитального (2 тип); оспы ветряной (3 тип); герпеса простого (тип1); Эпштейна-Барр (4 тип); цитомегаловируса (5 тип); 6-го типа – причины инфекционной розеолы, пневмонии интерстициальной; 7-го типа – причины экзантемы внезапной, предполагаемой причины синдрома хронической усталости; 8-го типа, ассоциируемого с саркомой Капоши;
• папилломавирусной – с целью выявления типа вируса и его групповой принадлежности (высокой онкогенной активности – 16го, 18го и других типов, связанных с развитием рака шейки матки, низкой – преимущественно 6го и 11го типов, вызывающих появление аногенитальных бородавок);
• хламидийной (особенно рекомендуется беременным, проводится при первичном обращении к доктору и в 3-ем триместре);
• мико- и уреаплазменной;
• гонококковой (диагностика данным методом распространена в РФ);
• трихомонадной;
• кандидозной при подозрении на воздействие нетипичных представителей грибов дрожжеподобных рода Candida (Candida nonalbicans, в отличие более привычных Candida albicans, отличаются повышенной стойкостью к обычным противогрибковым препаратам);
• туберкулезной;
• ВИЧ;
• гепатитов и пр.

Помимо этого, метод ПЦР диагностики является основным исследовательским вариантом при подозрении на вагиноз бактериальный.

Позволяя обнаружить такие маркеры данного состояния, как гарднереллы, мобилинкус и пр., определить состав микрофлоры влагалища с целью подбора адекватных терапевтических схем.

ПЦР диагностика используется в обнаружении опухолевых образований и генетических отклонений.

Модификацией метода является его комбинация с предшествующим разрезанием молекулы ДНК особыми ферментами – эндонуклеазами.

Данное исследование называется ПЦР-рестрикционным анализом продуктов амплификации (PCR RFLP) и распространено в иммунологии.

ПЦР находит применение не только в диагностике инфекционных болезней.

Но также и для выявления наследственных патологий, установления отцовства, в исследовательских целях для введения мутаций, клонирования генов или выделения новых, сращивания ДНК фрагментов.

Все это обуславливает интерес к методу в таких областях, как:

• судебная медицина;
• криминалистика;
• ветеринария;
• сельское хозяйство;
• палеонтология;
• антропология и пр.

Достоинства и недостатки

К лаборатории, осуществляющей ПЦР-диагностику, предъявляются высочайшие требования в плане оборудования, тест-систем и квалификации медицинского персонала. Это высокотехнологичная лаборатория, располагающая арсеналом высокочувствительных и высокоспецифичных реагентов, поэтому особых недостатков она не имеет. Разве что выдает положительный результат при отсутствии клинических проявлений и тем самым ставит лечебника перед дилеммой: стоит начинать лечение или нет?

Врач, наблюдающий пациента, начинает сомневаться в достоверности результатов тестирования, поскольку никаких признаков заболевания не видит. Но все же, учитывая высокую чувствительность ПЦР-системы, следует помнить, что она обнаруживает возбудителя даже в доклинической стадии, а положительный результат в таком случае является скорее достоинством, чем недостатком

Исходя из этого, лечащий врач должен сам принять решение о целесообразности терапии, взяв во внимание и другие аргументы «за» и «против»

Преимущества диагностики с помощью полимеразной цепной реакции очевидны:

• Высокая специфичность, достигающая 100%, обусловленная присутствием в отобранном образце частиц нуклеиновых кислот, присущих конкретному организму, но чужеродных человеку;
• Высокая производительность, ведь ПЦР – высокотехнологичная автоматизированная методика, предоставляющая возможность проведения тестирования в день забора материала и избавления, таким образом, пациента от лишних треволнений;
• ПЦР, работая над одной пробой, способна провести несколько исследований и обнаружить несколько возбудителей, если ей будет такое задание. Например, при диагностике хламидийной инфекции, где ПЦР относится к основным методам, наряду с хламидией, можно обнаружить и нейссерию (гонококк) – возбудитель гонореи. Причем, на достоверности результатов это негативно не отражается;
• Тестирование методом ПЦР выявляет опасные микроорганизмы в инкубационном периоде, когда они еще не успели нанести ощутимый вред организму, то есть, ранняя диагностика предупреждает о грядущем развитии патологического процесса, что дает возможность подготовиться к нему и принять во всеоружии.

Кроме этого, во избежание недоразумений, иной раз возникающих при диагностике, ПЦР защищает себя еще и тем, что ее результаты могут  зафиксироваться (фотография, компьютер) с целью использования их в экспертных целях, если будет на то необходимость.

Нормой в ответах ПЦР считают отрицательный результат, указывающий на отсутствие фрагментов чужеродных нуклеиновых кислот, положительный ответ будет свидетельствовать о наличии инфекции в организме, цифровые значения означают состояние вируса и его концентрацию на момент тестирования. Однако полную расшифровку анализа осуществляет врач, прошедший специальную учебу по теме «ПЦР». Пытаться же интерпретировать результаты самостоятельно не имеет никакого смысла, поскольку можно, что скорее всего и произойдет, неправильно понять и начать заранее волноваться.

Описание метода

Процедура кПЦР похожа на процедуру классической ПЦР, то есть присутствуют все стадии реакции — плавление двухцепочечных ДНК при температуре 95˚C, отжиг праймеров (температура отжига зависит от используемых праймеров) и элонгация при температуре 72˚С, если используется Taq-полимераза. Количество ПЦР-продукта измеряется в каждом цикле ПЦР с помощью флуоресцентных меток. Таким образом, сила сигнала говорит о первоначальном количестве интересующей молекулы.

График амплификации

График амплификации в кПЦР

Номенклатура, обычно используемая для кПЦР:

1. Базовая линия — это циклы ПЦР, в которых флуоресцентный сигнал ниже значения, которое может зарегистрировать прибор.
2. ΔRn — приращение флуоресцентного сигнала в каждый момент времени.
3. Пороговая линия — это произвольный уровень флуоресценции, выбранный на основе базовой линии. Сигнал, который обнаружен выше порога, считается реальным сигналом, который можно использовать для определения порогового цикла (Ct) для образца. Порог можно регулировать для каждого эксперимента, чтобы он находился в области экспоненциального роста на всех графиках.
4. Пороговое число циклов (Ct) — это число циклов ПЦР, при котором флуоресценция превышает пороговое значение.

График состоит из базовой линии, экспоненциальной фазы и плато.

А — график амплификации. Зависимость уровня флуоресценции от цикла ПЦР для нескольких образцов. В — кривая плавления. На оси ординат производная флуоресценции по температуре со знаком минус, на оси абсцисс — температура. С — кривая плавления. Уровень флуоресценции по времени

На начальных этапах флуоресценция слабая, так как продукта мало, поэтому её трудно отличить от фона. По мере накопления продукта, сигнал растёт сначала экспоненциально, а затем выходит на плато. Выход на плато объясняется нехваткой того или иного компонента реакции — могут закончиться праймеры, нуклеотидилтрифосфаты, флуоресцентная метка. Если продукта реакции накопилось слишком много, то лимитирующим фактором может стать полимераза, и тогда зависимость количества продукта от цикла станет линейной. Стоит отметить, что в стандартной реакции ПЦР в реальном времени все образцы выйдут на плато и достигнут примерно одного уровня сигнала. Таким образом, конечная точка ничего не скажет о начальном количестве исследуемого образца. С другой стороны, в экспоненциальной фазе можно проследить отличия в скорости роста количества продукта. Различия в начальном количестве молекул влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума.

Ct — число, по которому можно судить о количестве целевой ДНК в растворе, но Сt-величина может зависеть от многих случайных факторов, например,чувствительности детектора, качества фильтра и пр. Поэтому точное начальное количество интересующего продукта измерить нельзя. Для решения этой проблемы существуют методы нормировки. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе.
Нормируют обычно на продукты генов домашнего хозяйства — генов, количество которых в клетке всегда примерно одинаковое (пример — ген infA, кодирующий фактор инициации трансляции у бактерий).
Соотношение определяют по следующей формуле:

NANB=(1+E)(CtB−CtA){\displaystyle _{A}/_{B}=(1+\mathrm {E} )^{(\mathrm {Ct} _{B}-\mathrm {Ct} _{A})}}

где NA{\displaystyle _{A}} и NB{\displaystyle _{B}} — начальные количества двух образцов, Ct_B и Ct_А — соответствующие Ct-величины, а E{\displaystyle \mathrm {E} } — эффективность ПЦР, которая часто приравнивается к 1{\displaystyle 1} или ,9{\displaystyle 0,9}.

Анализ кривой плавления

ПЦР в реальном времени позволяет идентифицировать конкретные амплифицированные фрагменты ДНК, используя анализ их температуры плавления (денатурации), также называемый величиной Tm. В методе используются интеркалирующие красители, обычно это SYBR Green. Температура плавления ДНК специфична для амплифицированного фрагмента. Результаты этого метода получены путём сравнения кривых диссоциации анализируемых образцов ДНК. Для анализа строится две кривые плавления. Первая — это зависимость флуоресценции по времени, вторая — скорость падения флуоресценции по времени. Пик отражает определённый образец ДНК.

ПЦР диагностика – что это

ПЦР диагностика использует методы, которым доступно выявлять РНК и ДНК (нуклеиновые кислоты) организмов, находящихся в любом биологическом материале человеческого организма: крови, моче, тканях, слизи, слюне, мокроте и прочем.

Выбор забора биологического материала для целей лабораторных исследований остается за лечащим врачом. Правильная расшифровка результатов от которого и зависит для постановки диагноза и будущего лечения также лежит на плечах врача. Пользуется успехом, например, ПЦР анализ крови.

При диагностировании специализированный медик с опытом практики выявляет предполагаемую информативную среду обитания тех либо иных вредоносных организмов. Стоимость диагностирования ПЦР способом в каждой лаборатории либо исследовательском центре разнится.

Методом диагностики ПЦР выявляются не просто ДНК либо РНК генетического инфекционного генома, но и распознаются индивидуальные характерные признаки, присущие определенному типу микроорганизмов.

  Восстановить картину для исследования методике удается с помощью полимеразной цепной реакции, то есть многократного копирования и размножения субъекта вне человеческого организма в лабораторных условиях. Стоит разобраться, как же это такое размножение помогает выявить заболевания на ранних этапах развития.

Так каждый микроорганизм наделен генетической информацией (это ДНК) вне зависимости от размеров. Основное правило генетики говорит о комплементарности. Другими словами, ДНК состоит из 4-х нуклеотидов, а соседствующие спирали воссоединяются в определенном биологией порядке, и никак не иначе. Дабы выявить ДНК определенного биологического создания, достаточно получить небольшой фрагмент, так называемое хранилище основополагающей генетической информации для исследования.

Стоит отметить, что некоторые подвиды организмов могут хранить генетический код информации в иного рода нуклеиновой кислоте (РНК), как, например, это иммунодефицит организма человека. Методика ПЦР отыскивает и это.

  Фрагменты такого типа и выявляются рассматриваемой уникальной методикой ПЦР, где принцип деятельности основан на обнаружении отдельного микроорганизма. Для каждого исследуемого чужеродного организма создан в практике генетический специфический детектор, который отыскивает «родственный» фрагмент РНК либо ДНК, запуская деятельность воссоздания и размножения его копий в огромном количестве.

Всего на протяжении нескольких минут в лабораторных условиях допустимо получить многомиллиардное количество отысканной вредоносной молекулы. Таким образом, определяется тип возбудителя инфекций конкретного заболевания.

Эффективность ПЦР

Степень эффективности полимеразной цепной реакции тоже влияет на величину C_T. Сравнивая серии разведений, амплифицированых в условиях низкой и высокой эффективности реакции, мы обнаружим, что кривые амплификации имеют разный угол наклона. На рисунке 5, два образца (X и Y), амплифицированые в условиях низкой и высокой эффективности реакции, показывают различные значения C_T при одной и той же концентрации ДНК-матрицы. В этом примере, кривая амплификации при высокой эффективности реакции (синий график на рисунке 5) дает более низкое значение C_T при высокой концентрации ДНК-матрицы, хотя она имеет более высокую чувствительность при низкой концентрации ДНК-матрицы.

Рисунок 5.

Рис. 5. Синяя стандартная кривая отображает 100% эффективность реакции (наклон -3,3). Зеленая стандартная кривая отображает 78% эффективность реакции (наклон -4). При амплификации Y молекул ДНК-матрицы в условиях низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает раньше, чем в условиях высокой эффективности реакции. При меньшем количестве молекул ДНК-матрицы происходит наоборот – при низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает позже, чем в условиях высокой эффективности реакции.

Эффективность ПЦР зависит от типа анализа, качества реакционной смеси и качества ДНК в образце. Как правило, эффективность реакции 90-110% считается приемлемой.

Различие в значении C_T для двух образцов может достоверно свидетельствовать о различной концентрации ДНК-матрицы в этих образцах только при условии одинаковых настройках оборудования, реактивов и типа анализа. Однако, если анализ был проведен на разном оборудовании, были использованы разные реактивы, праймеры или зонды, либо реакции проводились в разных объемах – различия в значениях C_T не дадут нам достоверной информации. Следовательно, абсолютные значения C_T имеет смысл сравнивать только в том случае, если все условия реакции были абсолютно одинаковыми.

Зонд или SYBR® Green. Выбор правильной системы визуализации для вашего эксперимента.

SYBR Green (или любой другой интеркалирующий краситель)

SYBR Green является наиболее используемым интеркалирующим красителем в современной практике. Кроме него существует множество других красителей подобного класса, но наверняка вы слышали именно о SYBR Green. Принцип действия у них один: сам краситель имеет собственный флуоресцентный фон, но связываясь с двухцепочечной ДНК, он встраивается между ее цепочками. Это приводит к изменению конфигурации молекулы красителя, заставляя ее  флуоресцировать горазда сильнее. Все просто – чем больше ДНК образуется в процессе ПЦР, тем сильнее происходит флуоресценция в образце.

Какие заболевания можно выявить с помощью ПЦР

С помощью ПЦР можно выявить практически любые вирусные и бактериальные заболевания. Для анализа используется не только кровь, но и другие биологические материалы: сперма, слюна, мазки из уретры и с шейки матки. Анализ крови будет информативен в том случае, если возбудитель конкретного заболевания проникает в кровь человека. Поэтому ПЦР крови назначают при следующих заболеваниях:

• вирусные гепатиты А, В, С, D и TT;
• цитомегаловирус;
• герпетическая инфекция (вирусы герпеса 1, 2 и 4-го типов);
• ВИЧ-инфекция
• энтеровирусная инфекция;
• опоясывающий лишай;
• краснуха;
• токсоплазмоз;
• инфекционный мононуклеоз;
• листериоз.

Если же взять во внимание возможность проведения ПЦР других биоматериалов, то в список заболеваний, выявляемых с помощью ПЦР, следует добавить:

• гарднереллез;
• сальмонеллез;
• дифтерия;
• туберкулез;
• папилломавирусную инфекцию (порядка 100 различных штаммов вируса папилломы человека);
• трихомониаз;
• микоплазмоз.

Особо актуально в настоящее время ПЦР анализа крови беременной на так называемые TORCH-инфекции: цитомегаловирус, токсоплазмоз, краснуху и герпесвирусную инфекцию. Связано это с тем, что упомянутые заболевания могут привести к аномалиям развития плода.